Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue

硬組織線(xiàn)粒體分離試劑盒

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基本描述

硬組織線(xiàn)粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue）是一款快速便捷的分離動(dòng)物硬組織（如：骨骼?。┚€(xiàn)粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線(xiàn)粒體的同時(shí)，還能獲得不含線(xiàn)粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素c等線(xiàn)粒體蛋白向胞漿的釋放。經(jīng)本試劑盒獲得的大部分線(xiàn)粒體都含有完整的內膜和外膜，且維持線(xiàn)粒體生理功能，因此，分離所得的線(xiàn)粒體可用于線(xiàn)粒體膜電位等生理功能相關(guān)研究。另外，分離得到的線(xiàn)粒體也可被線(xiàn)粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

本試劑盒適用于從動(dòng)物硬組織（比如：心肌、骨骼?。┗蚱渌y以分離線(xiàn)粒體的組織中提取線(xiàn)粒體。

產(chǎn)品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 進(jìn)行實(shí)驗之前務(wù)必閱讀試劑盒操作流程，根據最終實(shí)驗目的選擇試劑盒內所要用到的試劑。

2） 若不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品，不必往線(xiàn)粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3） 分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時(shí)間盡量控制在1h之內。

4） 通常，在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取1000g和12,000g，如果希望純度更高，但對線(xiàn)粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5） 試劑開(kāi)封后請盡快使用，以免影響后續實(shí)驗效果。

6） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

自備材料

1）（可選）BCA蛋白定量檢測試劑盒或Bradford蛋白濃度測定試劑盒

2）尼龍網(wǎng)或細胞篩

3）低速離心機

4）勻漿器

使用方法

1. 試劑準備：從冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果實(shí)驗目的是為了制備線(xiàn)粒體蛋白樣品，需在線(xiàn)粒體裂解緩沖液和清洗液內添加PMSF (100×)，使其終濃度為PMSF (1×)。PMSF一定要在試劑加入到樣品前1-2min內加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2. 清洗：動(dòng)物禁食24h后處死，取新鮮橫紋肌等組織（不宜采用凍存組織），迅速稱(chēng)重50~100mg，用預冷的清洗液清洗2次，棄清洗液，于冰上剪成30mm2大小的組織碎片。

3. 裂解：加入10倍體積預冷的線(xiàn)粒體裂解液，置于冰浴5-10min。

4. 勻漿I：轉移到預冷的Dounce勻漿器中，勻漿10-20次?；虿捎秒妱?dòng)勻漿器，700rpm，8-10次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數有所不同，需自行優(yōu)化?！咀⒁狻浚喝绻M織重量為100mg，可以粗略認為組織的體積接近100μl，此時(shí)需加入1000μl線(xiàn)粒體裂解液。

5. 勻漿II：4℃攪拌孵育5-10min。用等體積的線(xiàn)粒體儲存液稀釋至勻漿液，再次重復步驟4。

6. 離心：用尼龍網(wǎng)或細胞篩網(wǎng)過(guò)濾勻漿液，4℃ 1000g離心15min，重復1次，以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片?！咀⒁狻浚喝缧璜@得純度更高的線(xiàn)粒體，可以將此步驟的離心速度改為2000g離心10min，缺點(diǎn)是相同數量細胞的線(xiàn)粒體抽提得率會(huì )下降。

7. 上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 12000g離心10min?！咀⒁狻浚喝缧璜@得純度更高的線(xiàn)粒體，可以將此步驟的離心速度改為6000g離心10min，缺點(diǎn)是相同數量細胞的線(xiàn)粒體抽提得率會(huì )下降。

8. 棄上清，沉淀即為線(xiàn)粒體?！咀⒁狻浚喝绻Ｍ@得去除線(xiàn)粒體后的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，且在收集上清的過(guò)程中不要觸及沉淀，隨后把收集的上清4℃ 12000g 離心10min，此時(shí)的上清即為去除線(xiàn)粒體的細胞漿蛋白。

9. 保存：棄上清，用適當的緩沖液懸浮沉淀。如果用于線(xiàn)粒體酶活性或功能分析，線(xiàn)粒體沉淀需重懸于線(xiàn)粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應保存于蛋白保存液（1×），即按照：細胞漿蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應使用其它適宜的保存液。

【注意】：使用本試劑盒中的線(xiàn)粒體儲存液稀釋或儲存的線(xiàn)粒體樣品應及時(shí)使用，以免線(xiàn)粒體膜電位受影響。如果不能及時(shí)使用，建議在-80℃保存。凍存后的線(xiàn)粒體樣品不推薦用于膜電位的檢測，但可以用線(xiàn)粒體蛋白或核酸的相關(guān)檢測。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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