近期有很多客戶(hù)使用我司（懋康生物）的Zymolyase-20T（酵母裂解酶，酵母溶壁酶）（Cat#：MF0212），經(jīng)常問(wèn)到產(chǎn)品如何溶解，使用劑量等問(wèn)題，現對以下問(wèn)題做出描述。有更多的問(wèn)題，請和我司聯(lián)系，或發(fā)郵件到tech@maokangbio.com。
常見(jiàn)問(wèn)題（Frequently asked questions）：
一、 產(chǎn)品如何保存？
答復：本品以?xún)龈煞坌问教峁?，收到產(chǎn)品需2-8℃干燥保存。本品置于30℃，3個(gè)月酶活力損失約70%。本品溶于緩沖液配制成儲存液后，短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長(cháng)期請置于-20℃保存，約數月穩定。
二、 凍干粉如何溶解？
答復：本品易溶于水。建議用1/15M phosphate buffer（pH 7.5）溶解，或用自己實(shí)驗體系相關(guān)緩沖液來(lái)溶解。儲存液的制備方法比較多，主要根據自身的實(shí)驗體系，或參考文獻來(lái)操作。短期置于2-8℃保存，約2周穩定。長(cháng)期請置于-20℃保存，約數月穩定。
三、 如何制備無(wú)菌酶溶液？
答復：若需要制備無(wú)菌酶溶液，請用除硝酸纖維素膜之外的0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌。
四、 酶的比活力是多少？
答復：Zymolyase-20T指的是酶的比活力約20，000 units/g (20 Ku/mg)，具體批次酶的比活力是有變化的，詳細請見(jiàn)產(chǎn)品標簽或質(zhì)檢報告。
五、 Zymolyase適用于哪些菌株類(lèi)型？
答復：該酶的裂解譜（lytic spectrum）包含以下菌屬：Ashbya（阿舒囊霉屬）, Candida（假絲酵母菌屬）, Debaryomyces（德巴利（氏）酵母屬）, Eremothecium(假囊酵母屬), Endomyces(內孢霉), Hansenula(漢遜氏酵母), Hanseniaspora(孢漢遜酵母屬), Kloeckera(克勒克酵母屬), kluyveromyces（克魯維酵母屬）, Lipomyces(油脂酵母屬), Metschnikowia(梅奇酵母屬), Pichia(畢赤酵母屬), Pullularia(芽霉菌屬), Torulopsis(球擬酵母菌), Saccharomyces(酵母屬), Saccharomycopsis(復膜酵母菌屬), Saccharomycodes(類(lèi)酵母屬), Schwanniomyces(許旺酵母菌屬)，等等。其他未羅列在內的菌屬請查閱文獻或和我司聯(lián)系是否有相關(guān)應用數據。
六、 Zymolyase適用于絲狀真菌嗎？
答復：該酶主要用于酵母細胞壁的裂解，對于絲狀真菌，雖然與酵母細胞壁在結構上有很多相似，但裂解效果因菌株類(lèi)型有差異。建議用復合酶的形式來(lái)特異裂解絲狀真菌，或選用我司（懋康生物）提供的真菌溶壁酶（Cat#:MX7356）。
七、酶的工作濃度一般是多少？
不同的酵母菌株對酶的敏感性會(huì )有差異，請參閱文獻或根據實(shí)際的裂解經(jīng)驗來(lái)設定合適的工作濃度。操作方法可參考下方流程。
操作步驟（僅作參考，實(shí)際應用可做適當調整）：
一、Zymolyase-20T儲存液制備
此配制方法針對以下步驟來(lái)設置，也可以適用其他適當的溶劑如1/15M phosphate buffer(pH 7.5) 、10mM Tris-HCl buffer（pH 7.5）等。
將低溫保存的凍干粉從冰箱取出，回置室溫，低速離心后，稱(chēng)取適量粉末溶于無(wú)菌S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）配制成10mg/ml（200U/ml）儲存液，置于4℃能穩定保存2周（無(wú)菌條件下）。
二、制備原生質(zhì)球（Spheroplasting protocol）
2.1 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物；
2.2 吸掉上清，收集離心沉淀（酵母細胞），記錄濕重；
2.3 用TE緩沖液（100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA）重懸酵母細胞，按照1.4ml/g濕重細胞加量。并用去離子水定容到終體積 3.5ml/g濕重細胞。
2.4 按照17.5 μl/g濕重細胞加入? -巰基乙醇，目的是為了除去細胞外層甘露聚糖層；
2.5 30°C孵育并保持低速搖晃，處于對數期生長(cháng)的酵母孵育15min，處于穩定期生長(cháng)的酵母孵45min；
2.7 用S緩沖液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）重懸細胞，加4.0ml S緩沖液/g濕重細胞；
2.9 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）重懸細胞，另加入Zymolyases（50U/g濕重細胞，對200U/ml儲存液，則加入250μl）；初始用此酶，最好根據實(shí)際情況進(jìn)行用量的優(yōu)化。
2.10 30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下方式監測原生質(zhì)球形成程度：
a）加1μl樣品到20μl S 緩沖液內，原生質(zhì)球應該保持完整；b）加1μl樣品到20μl去離子水中，原生質(zhì)球應該破裂；顯微鏡下觀(guān)察比較兩個(gè)樣品。
2.11 一般情況下反應45-60min，原生質(zhì)球的形成量>90%，此時(shí)4oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；
2.12 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）重懸原生質(zhì)球，5000rpm離心5min；重復此步驟2次。
2.13 原生質(zhì)球沉淀可置于-70oC凍存。
三、酵母基因組DNA的制備（Preparation of yeast genomic DNA）
以下操作步驟簡(jiǎn)單快速，適合于少量酵母培養物內基因組DNA的制備。
3.1 將過(guò)夜培養的10ml酵母菌培養物離心收集沉淀，加入280μl TE Buffer，300 μl 去離子水和3 μl ? -巰基乙醇；
3.3 30oC溫育45min；
3.3 以臺式離心機的最高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀用500μl S 緩沖液重懸.；再次離心棄上清；
3.4 用500μl含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S緩沖液重懸沉淀（或者使用自行優(yōu)化后的最佳酶濃度）；
3.5 30oC溫育1h；
3.6 重復步驟3.3；
3.7 用200μl含有0.1%SDS和2ug蛋白酶K的TE buffer重懸沉淀；
3.8 37oC溫育3小時(shí)，中間時(shí)不時(shí)的混勻下溶液；
3.9 轉到65oC溫育20min；從水浴鍋內取出并冷卻至室溫；
3.10 用200μl 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內取出并保留上清液；
3.11 用200μl氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；
3.12 加入500μl 95%乙醇到上清液內，20oC沉淀10min；
3.13 4oC下，15,000 xg離心20 min；
3.14 自然風(fēng)干或者于真空離心蒸發(fā)濃縮器內晾干除去多余的乙醇，并加入200μl TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 μg RNase A）溶解DNA；
3.15 37oC溫育1小時(shí)；
3.16 重復步驟3.10和3.11；
3.17 加入2.5倍體積的95%乙醇，20oC沉淀10min；
3.18 30μl去離子水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據消光系數計算DNA產(chǎn)量；產(chǎn)量大約為40-50μg。
