D-luciferin D-熒光素/D-熒光素鉀鹽/D-熒光素鈉鹽常見(jiàn)問(wèn)題

1. D-熒光素（D-luciferin）適合用于哪些實(shí)驗？

作為螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）的作用底物，常常用于以下實(shí)驗，

1）  體內活體成像In vivo imaging；熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染疾病通常注射入研究動(dòng)物模型比如大小鼠內進(jìn)行研究，從而對動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)時(shí)和非侵略性的監測疾病進(jìn)程和/或藥效。

2）  體外研究In vitro study，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。

2. D-熒光素（D-luciferin）的作用原理如何？

作用機制：在A(yíng)TP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。

機理闡釋?zhuān)w內）：熒光素酶（Luc）催化底物D-熒光素，利用ATP和Mg2+作為輔因子，氧氣存在下發(fā)射一典型的黃綠光，之后在體內37℃下遷移到紅光。

機理闡釋?zhuān)w外）：很多因素都可能影響反應靈敏性，包括溫度、pH或底物濃度。建議使用pH 7.8的緩沖液，并且使用前將所有試劑預熱到室溫。建議反應緩沖液內添加過(guò)量的ATP和Mg2+以達到最佳反應狀態(tài)。

3. 甲蟲(chóng)熒光素（Beetle luciferin）和熒光蟲(chóng)熒光素（Firefly luciferin）之間有差別？

兩者之間沒(méi)有差別，僅是不同公司命名上的差異，化學(xué)結構一致。

4. 熒光素（luciferin）如何溶解，穩定性如何？

很多文獻和一些客戶(hù)提及用水溶解D-熒光素，之后置于-80℃分裝凍存，基本沒(méi)有明顯毒性效應。鉀鹽溶解性通常是60mg/ml，而鈉鹽溶解性高達100mg/ml（游離酸不溶于水，但溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml）。但是，關(guān)于溶解的D-熒光素穩定性存在爭議報道，可能由于水中含有的氧氣而破壞穩定性。最好將D-熒光素溶于無(wú)氣水（degassed H2O），保存效果最佳。

對最靈敏的實(shí)驗，然而，強烈建議使用新鮮配制的反應液以降低實(shí)驗中的可變性（比如，低濃度酶或次優(yōu)溫度或次優(yōu)鹽離子濃度可能需要高濃度底物來(lái)驅動(dòng)反應完全進(jìn)行）。

5. D-熒光素鉀鹽和D-熒光素鈉鹽之間有差別？

兩者之間基本無(wú)差別，可能在物理特性上有些小差別，比如D-熒光素鈉鹽有點(diǎn)更顆粒狀和水溶性更由于鉀鹽。另外，從報道文獻來(lái)看約3倍多的文獻用鉀鹽，許多研究者體內更傾向于鉀鹽，但任何一種效果一致。

6. D-熒光素鉀鹽/鈉鹽和D-熒光素游離酸之間有差別？

D-熒光素游離酸不溶于水，除非溶于稀堿比如NaOH或KOH調整過(guò)pH的水。溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml。然而，D-熒光素鉀鹽或鈉鹽在實(shí)驗中使用更方便，特別是體內成像，由于很容易溶于水或緩沖液，對檢測系統的毒性更低。

7. 為什么D-熒光素鉀鹽/鈉鹽要溶于無(wú)Ca2+或Mg2+的PBS？其他鹽溶液能用于溶解D-熒光素鉀鹽/鈉鹽?

PBS，或磷酸緩沖鹽和DPBS都是生物學(xué)研究的常用緩沖鹽，通常用于細胞相關(guān)的研究中。PBS/DPBS是等滲緩緩沖液（比如與人身體兼容）。這些緩沖液專(zhuān)門(mén)設計能提供和維持穩定pH 7.2-7.6。PBS和DPBS之間沒(méi)差別，雖然后者無(wú)Ca2+/ Mg2+。鈣鎂溶液可能會(huì )限制胰酶活性。另外，Mg2+是催化D-熒光素生成氧化熒光素的關(guān)鍵成分（而Ca2+以相似的活性參與腔腸素催化）。其他鹽溶液可能用來(lái)溶解D-熒光素，只要存在的陽(yáng)離子不會(huì )干擾實(shí)驗結果或產(chǎn)生脫靶效應。

8. D-熒光素在體內如何分布？

D-熒光素注射入動(dòng)物體內后能快速分布且很容易分散到全身。

9. D-熒光素的體內發(fā)光動(dòng)力性?

D-熒光素的給藥方式很多，常用的有腹腔注射、皮下注射和靜脈注射，不同的給藥方式動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)有差異，見(jiàn)下圖片。對于大部分研究，腹腔/皮下注射約10-20min后達到熒光信號峰值，靜脈注射約2-5min達到信號峰值?！緢D片來(lái)自：Bollinger, Robert Albin. Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.】

10. 動(dòng)物對重復注射D-熒光素的反應如何?

D-熒光素不會(huì )影響動(dòng)物（沒(méi)有明顯毒性或免疫反應）。

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