活體成像研究底物之：
Firefly D-Luciferin D-蟲(chóng)熒光素（Luc基因）
（活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉錄水平研究）
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【重要提示】： |
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1）見(jiàn)我司懋康生物（MKBio）整理的活體成像研究底物之：腔腸素（Coelenterazine）產(chǎn)品專(zhuān)題； |
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2）見(jiàn)我司懋康生物（MKBio）整理的活體成像研究底物之：D-熒光素（D-luciferin）產(chǎn)品專(zhuān)題； |
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3）見(jiàn)我司懋康生物（MKBio）整理的D-熒光素（D-luciferin）常見(jiàn)問(wèn)題； |
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4）見(jiàn)我司懋康生物（MKBio）整理的D-熒光素（D-luciferin）體外使用指南；敬請期待。。。。 |
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5）見(jiàn)我司懋康生物（MKBio）整理的D-熒光素（D-luciferin）體內使用指南；敬請期待。。。。 |
搜索關(guān)鍵詞：
Luc reporter gene 報告基因；Luciferase 螢火蟲(chóng)熒光素酶；In vivo imaging 活體成像研究；熒光素酶/ATP水平研究；報告基因質(zhì)粒；報告基因病毒顆粒；螢火蟲(chóng)熒光素；甲蟲(chóng)熒光素；CAS：103404-75-7；
基本描述：
D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內活體成像技術(shù)。作用機制是在A(yíng)TP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉染進(jìn)入細胞后，導入研究動(dòng)物如大小鼠體內，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測光強度變化，從而實(shí)時(shí)監測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發(fā)光強度的變化來(lái)指示能量或生命體征。
基本應用：
1）體內活體成像In vivo imaging；熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染疾病通常注射入研究動(dòng)物模型比如大小鼠內進(jìn)行研究，從而對動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)時(shí)和非侵略性的監測疾病進(jìn)程和/或藥效。
2）體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。
常見(jiàn)商業(yè)化類(lèi)型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：
目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。
1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。
2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無(wú)毒性，特別適合體內實(shí)驗。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數應用上都沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的差別。
3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒(méi)有差別，主要是使用習慣等因素影響。整體來(lái)看，鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。
使用方法【體內成像/腹腔注射】
一． 儲存液制備（Luciferin preparation）
1.1 將D-熒光素鉀鹽（或D-熒光素鈉鹽）凍干粉回至室溫，溶于DPBS（無(wú)鈣/鎂）使其終濃度為15mg/ml。
1.2 用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，條件許可現配現用。若單次實(shí)在用不完，則分裝后置于≤-20℃保存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。
二．動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)建立（Kinetic curve）
由于D-熒光素進(jìn)入體內的生物分布非?？焖偾覄?dòng)力學(xué)具組織依賴(lài)性，因此，研究人員需正式實(shí)驗前確定自身動(dòng)物在D-熒光素注射后的成像采集最佳時(shí)間。通過(guò)建立動(dòng)物模型的熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)來(lái)完成。
D-熒光素給藥的方式有腹腔注射（ip）、靜脈注射（iv）或皮下注射（sc），通常給藥方式為腹腔和靜脈。以下以腹腔注射為例。
2.1 如下腹腔注射（i.p.）D-熒光素。如果給藥前需麻醉小鼠，需要注意此步操作可能稍微延長(cháng)動(dòng)力學(xué)（熒光素酶峰值表達時(shí)間）。
2.2 a）如果在動(dòng)物保持清醒時(shí)給藥，等待三分鐘，之后按照所選方法麻醉動(dòng)物（氣化或注射麻醉）。b）將麻醉后動(dòng)物置于成像室內，給藥后約5min開(kāi)始第一次拍照。
2.3 對于腹腔注射模型，每5-10min（最長(cháng)達40-60min）拍一次照以建立熒光素酶表達的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)?！敬蠖鄶底⑸渎樽硭幊掷m20-30min，要完成一次完整的動(dòng)力學(xué)研究可能需要再給一次麻醉藥物。使用2%異氟烷氣體麻醉健康動(dòng)物能在活體成像系統如IVIS內安全放置45min?！?/span>
2.4 根據模型建立的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)選擇最佳時(shí)間點(diǎn)采集圖像?！驹S多模型研究表明腹腔或皮下注射后約10-20min達到信號峰值，靜脈注射后約2-5min達到信號峰值?！?/span>
三．腹腔注射（i.p.）技術(shù)要點(diǎn)
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最佳注射點(diǎn)（Preferred site） |
動(dòng)物左下腹部（lower left abdominal quadrant） |
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針頭大?。∟eedle size） |
25 gauge，通常與1ml（1 cc）注射器配套使用 |
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體積（Volume） |
每10g體重小鼠加入100μl 15mg/ml D-熒光素，相當于150mg/kg的給藥劑量?！靖骨粏未巫⑸?ml無(wú)刺激性溶液對動(dòng)物無(wú)任何壓力】。 |
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動(dòng)物位置（Position of animal）： |
手動(dòng)固定，背臥位（腹部向上），動(dòng)物顱（頭部）朝下。輕輕晃動(dòng)小鼠2-3次使得腸道向下移動(dòng)，在下腹區域創(chuàng )造一個(gè)空腔。 |
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注射（Injection）： |
Needle should be bevel-side up and slightly angled when entering the abdominal cavity. Penetrate just through abdominal wall (about 4-5mm). The tip of the needle should just penetrate the abdominal wall of the animal’s left lower abdominal quadrant. |
應用示例【生物化學(xué)發(fā)光體內成像】
Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.
Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained
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貨號 |
產(chǎn)品名稱(chēng) |
規格 |
價(jià)格（元） |
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MX4602-100MG |
100mg |
998 |
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MX4602-500MG |
500mg |
2500 |
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MX4602-1G |
1g |
4500 |
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MX4603-100MG |
100mg |
998 |
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MX4603-500MG |
500mg |
2500 |
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MX4603-1G |
1g |
4500 |
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MX4601-250MG |
250mg |
1800 |
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MX4601-500MG |
500mg |
3000 |
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MX4601-1000MG |
1g |
5800 |
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MX4604-10MG |
10mg |
1350 |
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MX4604-50MG |
50mg |
5440 |
注意事項
1） 我司懋康生物（MKBIO）提供所有產(chǎn)品僅作科研用途，請不要用于臨床或診療用途。
2） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。
附錄I 各種給藥途徑和模型動(dòng)物的建議位點(diǎn)、針頭大小和注射體積
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給藥途徑 |
倉鼠 |
小鼠 |
大鼠 |
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IM肌肉注射 |
位點(diǎn) 體積 大小 |
Quadriceps, gluteals ≤0.15 ml ＜23 gauge |
Quadriceps ≤0.03 ml ＜23 gauge |
Quadriceps, gluteals, triceps ≤0.25 ml ＜22 gauge |
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IP腹腔注射 |
位點(diǎn) 體積 大小 |
Lower right quadrant of abdomen ≤3 ml ＜21 gauge |
Lower right quadrant of abdomen ≤2 ml ＜25 gauge |
Lower right quadrant of abdomen ≤5 ml ＜22 gauge |
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IV靜脈注射 |
位點(diǎn) 體積 大小 |
Not recommended |
Lateral tail veins ≤0.5 ml ＜27 gauge |
Lateral tail or saphenous veins ≤2 ml slowly ＜22 gauge |
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Intragastric 灌胃 |
位點(diǎn) 體積 大小 |
Stomach N/A 18-22 gauge, 4-4.5cm long, Bulbed feeding needle |
Stomach 5-10ml/kg 18-22 gauge, 2-3cm long, Bulbed feeding needle |
Stomach 5-10ml/kg 15-18 gauge, 6-8cm long, Bulbed feeding needle or 8 French flexible catheter |
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SC皮下注射 |
位點(diǎn) 體積 大小 |
Neck, back ≤3 ml ＜21 gauge |
Neck, back ≤1 ml ＜22 gauge |
Neck, back，abdomen ≤5 ml ＜21 gauge |
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域研究的試劑、儀器和實(shí)驗室消耗品與實(shí)驗服務(wù)工作，主要從事細胞生物學(xué)、植物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)。生物制藥與診斷試劑研發(fā)生產(chǎn)等領(lǐng)域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經(jīng)營(yíng)理念。堅持"品質(zhì)保障"的原則為廣大客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。
